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蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠次級(jí)鍵，包括氫鍵、疏水鍵、鹽鍵以及范德華力(Van der Wasls力)等。這些次級(jí)鍵可存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)序號(hào)相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基的R基團(tuán)之間，因此蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要指氨基酸殘基的側(cè)鏈間的結(jié)合。次級(jí)鍵都是非共價(jià)鍵，易受環(huán)境中pH、溫度、離子強(qiáng)度等的影響，有變動(dòng)的可能性。二硫鍵不屬于次級(jí)鍵，但在某些肽鏈中能使遠(yuǎn)隔的二個(gè)肽段聯(lián)系在一起，這對(duì)于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上起著重要作用。
現(xiàn)也有認(rèn)為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子主鏈折疊盤曲形成構(gòu)象的基礎(chǔ)上，分子中的各個(gè)側(cè)鏈所形成一定的構(gòu)象。側(cè)鏈構(gòu)象主要是形成微區(qū)(或稱結(jié)構(gòu)域domain)。對(duì)球狀蛋白質(zhì)來說，形成疏水區(qū)和親水區(qū)。親水區(qū)多在蛋白質(zhì)分子表面，由很多親水側(cè)鏈組成。疏水區(qū)多在分子內(nèi)部，由疏水側(cè)鏈集中構(gòu)成，疏水區(qū)常形成一些“洞穴”或“口袋”，某些輔基就鑲嵌其中，成為活性部位。
具備三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)從其外形上看，有的細(xì)長(長軸比短軸大10倍以上)，屬于纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)，如絲心蛋白;有的長短軸相差不多基本上呈球形，屬于球狀蛋白質(zhì)(globular protein)，如血漿清蛋白、球蛋白、肌紅蛋白，球狀蛋白的疏水基多聚集在分子的內(nèi)部，而親水基則多分布在分子表面，因而球狀蛋白質(zhì)是親水的，更重要的是，多肽鏈經(jīng)過如此盤曲后，可形成某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域，例如酶的活性中心等。
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