用放射免疫分析進(jìn)行測(cè)定時(shí)分三個(gè)步驟，即抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)、B和F的分離及放射性的測(cè)量。

　　(一)抗原抗體反應(yīng)

　　將抗原(標(biāo)準(zhǔn)品和受檢標(biāo)本)、標(biāo)記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)一定時(shí)間，使競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)達(dá)到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對(duì)溫育的溫度和時(shí)間有不同的要求。如受檢標(biāo)本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度(15～37℃)進(jìn)行較短時(shí)間的溫育，反之應(yīng)在低溫(4℃)作較長(zhǎng)時(shí)間的溫育，形成的抗原抗體復(fù)合物較為牢固。

　　(二)B、F分離技術(shù)

　　在RIA反應(yīng)中，標(biāo)記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物(B)不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標(biāo)記抗原(F)的分離。另外對(duì)小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。

　　1.第二抗體沉淀法這是RIA中最常用的一種沉淀方法。將產(chǎn)生特異性抗體(第一抗體)的動(dòng)物(例如兔)的IgG免疫另一種動(dòng)物(例如羊)，制得羊抗兔IgG血清(第二抗體)。由于在本反應(yīng)系統(tǒng)中采用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成由抗原-第一抗體-第二抗體組成的雙抗體復(fù)合物。但因第一抗體濃度甚低，其復(fù)合物亦極少，無法進(jìn)行離心分離，為此在分離時(shí)加入一定量的與一抗同種動(dòng)物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復(fù)合物形成共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原(B)的沉淀物沉淀，與上清液中的游離標(biāo)記抗原(F)分離。

　　將第二抗體結(jié)合在顆粒狀的固相載體之上即成為固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡(jiǎn)便、快速。

　　2.聚乙二醇(PEG)沉淀法最近各種RIA反應(yīng)系統(tǒng)逐漸采用了PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點(diǎn)是制備方便，沉淀完全。缺點(diǎn)是非常特異性結(jié)合率比用第二抗體為高，且溫度高于30℃時(shí)沉淀物容易復(fù)溶。

　　3.PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡(jiǎn)便。

　　4.活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復(fù)合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后，加入葡聚糖-活性炭。放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標(biāo)記抗原。此法適用于測(cè)定類固醇激素，強(qiáng)心糖苷和各種藥物，因?yàn)樗鼈兪窍鄬?duì)非極性的，又比抗原抗體復(fù)合物小，易被活性炭吸附。

　　(三)放射性強(qiáng)度的測(cè)定

　　B、F分離后，即可進(jìn)行放射性強(qiáng)度測(cè)定。測(cè)量?jī)x器有兩類，液體閃爍計(jì)數(shù)儀(β射線，如3H、32P、14C等)和晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(β射線，如125、131I、57Cr等)。

　　計(jì)數(shù)單位是探測(cè)器輸出的電脈沖數(shù)，單位為cpm(計(jì)數(shù)/分)，也可用cps(計(jì)數(shù)/秒)表示。如果知道這個(gè)測(cè)量系統(tǒng)的效率，還可算出放射源的強(qiáng)度，即dpm(衰變/分)或dps(衰變/秒)。

　　每次測(cè)定均需作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以標(biāo)準(zhǔn)抗原的不同濃度為橫坐標(biāo)，以在測(cè)定中得到的相應(yīng)放射性強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖(圖16-3)。放射性強(qiáng)度可任選B或F，亦可用計(jì)算值B/(B+F)、B/F和B/B0。標(biāo)本應(yīng)作雙份測(cè)定，取其平均值，在制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)的受檢抗原濃度。