放射免疫分析的基本原理是標記抗原(Ag*)和非標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)的競爭結(jié)合反應(yīng)。它的反應(yīng)式為：

　　在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的�？贵w的量一般取用能結(jié)合40%～50%的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據(jù)標本中抗原量的不同，得到不同的反應(yīng)結(jié)果。

　　假設(shè)受檢標本中不含抗原時的反應(yīng)條件為：

　　4(Ag*)+2(Ab)→2(Ag*Ab)+2(Ag*)(2)

　　在標本中存在抗原時，舉例如下：

　　4(Ag*)+4(Ag)+(2Ab)→

　　1(Ag*Ab)+3(Ag*)+1(AgAb)+3(Ag)(3)

　　當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應(yīng)系統(tǒng)時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競爭結(jié)合特異性抗體。由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復(fù)合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應(yīng)地結(jié)合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結(jié)合，使標記抗原抗體復(fù)合物相應(yīng)減少，游離的標記抗原相應(yīng)增加，亦即抗原抗體復(fù)合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比(圖16-1)。若將抗原抗體復(fù)合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結(jié)合態(tài)的標記抗原(B)與游離態(tài)的標記抗原(F)的比值(B/F)，或算出其結(jié)合率[B/(B+F)]，這與標本中的抗量呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同劑量的標準抗原進行反應(yīng)，計算相應(yīng)的B/F，可以繪制出一條劑量反應(yīng)曲線(圖16-2)。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線上查出標本中抗原的含量。

　　(一)標記物

　　標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co;后者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g(1.74×104Ci/g)，有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g(4.5Ci/g)。兩者相比，1mol125I或14C結(jié)合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。

　　(二)標記方法

　　標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。

　　直接標記法是將125I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上。此法優(yōu)點是操作簡便，為125I和蛋白質(zhì)的單一步驟的結(jié)合反應(yīng)，它能使較多的125I結(jié)合在蛋白質(zhì)上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用于標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質(zhì)的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。

　　間接標記法(又稱連接法)是以125I標記在載體上，純化后再與蛋白質(zhì)結(jié)合。由于操作較復(fù)雜，標記蛋白質(zhì)的比放射性顯著低于直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質(zhì)。如直接法標記引起蛋白質(zhì)酪氨酸結(jié)構(gòu)改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。它的標記反應(yīng)較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入125I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。

　　氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中(pH7.5)，氯胺T將125I的I-氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應(yīng)式如下：

　　放射性碘標記率的高低與抗原(蛋白質(zhì)或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關(guān)，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。

　　標記方法：將純化抗原和125I加入小試管底部，然后將新鮮配制的氯胺T快速沖入，混勻振蕩數(shù)十秒～2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)。再加入KI溶液稀釋。然后在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數(shù)器測定放射性強度(脈沖數(shù)/min,cpm)，前部為標記抗原峰，后部為游離125I峰。在標記抗原峰試管內(nèi)加等量1%白蛋白作穩(wěn)定劑，此即為標記抗原液。

　　(三)標記物的鑒定

　　1.放射性游離碘的含量用三氯醋酸(預(yù)先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白)將所有蛋白質(zhì)沉淀，分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5%以下。標記抗原在貯存過久后，會出現(xiàn)標記物的脫碘，如游離碘超過5%則應(yīng)重新純化去除這部分游離碘。

　　2.免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應(yīng)盡量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應(yīng)后分離B和F，分別測定放射性，算出BT%。此值應(yīng)在80%以上，該值越大，表示抗原損傷越少。

　　3.放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg(或mCi/mmol)表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據(jù)放射性碘的利用率(或標記率)：

　　如：5μghGH用2mCiNa125I進行標記，標記率為40%，則

　　(四)抗血清的檢定

　　含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體而得�？寡�清的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性�？寡�清質(zhì)量的指標主要有親和常數(shù)、交叉反應(yīng)率和滴度。